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本制品是一款新型高保真PCR扩增预混液，包含改造的新型快速高保真DNA聚合酶，该酶具有5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'核酸外切酶活性。额外添加的热启动因子，可有效控制低温情况下的非特异扩增和酶活损耗，保证了PCR扩增的特异性和稳定性；特异性延伸因子则使其在延伸能力和扩增速度方面得到大幅提升，可有效扩增长达10kb的目的片段，扩增速度可达15sec/kb。

本制品为即用型预混液，反应时只需加入模板和引物即可快速高效完成PCR反应，减少操作过程中的污染几率。产品中不含溴酚蓝染料，PCR反应后需要加入DNA loading buffer方可进行电泳检测。PCR产物为平末端。

• 使用前，请上下轻轻颠倒混匀，避免产生气泡，防止因混合不均匀造成的反应效果不佳。
  
• 反应液的配制，请在冰上操作完成。
  
• 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 配置反应体系：
  建议的模板量：基因组DNA，50～200ng；质粒DNA，10pg～20ng；cDNA，1～5μL (不超过PCR反应总体积的1/10)。
  按下列组分配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)：
  

  成分	用量
  2×高保真PCR预混液	25μL
  PCR Forward Primer(10μM)	2.5μL
  PCR Reverse Primer(10μM)	2.5μL
  DNA模板	x μL
  ddH2O	至50μL

  • 引物终浓度为0.5μM可以得到较好的结果，反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。
    
  • 1×预混液中包含1.5mM Mg²⁺和1U/50μL的聚合酶。
• PCR仪程序设置：
  
  • 建议采用两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。
    

    步骤	温度	时间	循环数
    预变性	98℃	3min	1
    变性	98℃	10sec	30～35
    延伸	68℃	30sec/kb
    终延伸	72℃	5min	1

  • 由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。
    

    步骤	温度	时间	循环数
    预变性	98℃	3min	1
    变性	98℃	10sec	30～35
    退火	60℃	20sec
    延伸	72℃	30sec/kb
    终延伸	72℃	5min	1

  • 本制品中添加特异性延伸因子，使酶在延伸能力和扩增速度方面得到大幅提升。对于难扩增片段，若以上程序不能有效扩增，推荐以下程序。
    

    步骤	温度	时间	循环数
    预变性	98℃	3min	1
    变性	98℃	10sec	15 (每个循环 降低1℃)
    梯度退火	70～55℃	20sec
    延伸	72℃	30sec/kb
    变性	98℃	10sec	20
    退火	55℃	20sec
    延伸	72℃	30sec/kb
    终延伸	72℃	5min	1

  • 预变性程序设置：温度推荐98℃，时间为3min；若模板GC含量较高，预变性时间可延长2～7min。
    
  • 退火程序设置：温度推荐60℃，时间为20sec；也可以建立一个温度梯度寻找引物与模板结合的最适温度。
    
  • 延伸程序设置：温度推荐72℃，时间为30sec/kb；若模板比较复杂，可延长至60sec/kb。
    
  • 扩增产物：请将PCR扩增产物放置于-20℃保存，防止该酶降解扩增产物。扩增产物为平末端。